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為加強我國干細胞制劑和臨床研究質(zhì)量管理，國家衛(wèi)生計生委與食品藥品監(jiān)管總局根據(jù)《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》，共同組織制定了《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）》（可從國家衛(wèi)生計生委或食品藥品監(jiān)管總局網(wǎng)站下載）。
國家衛(wèi)生計生委辦公廳 食品藥品監(jiān)管總局辦公廳
2015年7月31日
干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）
一.前言
二.干細胞制劑的質(zhì)量控制
（一）干細胞的采集、分離及干細胞（系）的建立
（二）干細胞制劑的制備
（三）干細胞制劑的檢驗
（四）干細胞制劑的質(zhì)量研究
三.干細胞制劑的臨床前研究
（一）安全性評價
（二）有效性評價
名詞解釋
參考文獻
一.前言
干細胞是一類具有不同分化潛能，并在非分化狀態(tài)下自我更新的細胞。干細胞治療是指應用人自體或異體來源的干細胞經(jīng)體外操作后輸入（或植入）人體，用于疾病治療的過程。這種體外操作包括干細胞的分離、純化、擴增、修飾、干細胞（系）的建立、誘導分化、凍存和凍存后的復蘇等過程。用于細胞治療的干細胞主要包括成體干細胞、胚胎干細胞及誘導的多能性干細胞（iPSC）。成體干細胞包括自體或異體、胎兒或成人不同分化組織，以及發(fā)育相伴隨的組織（如臍帶、羊膜、胎盤等）來源的造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、各種類型的祖細胞或前體細胞等。
目前國內(nèi)外已開展了多項干細胞（指非造血干細胞）臨床應用研究，涉及多種干細胞類型及多種疾病類型。主要疾病類型包括骨關節(jié)疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應（GVHD）、脊髓損傷及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病等。其中許多干細胞類型，是從骨髓、脂肪組織、臍帶血、臍帶或胎盤組織來源的間充質(zhì)干細胞，它們具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調(diào)控能力等。
用于干細胞治療的細胞制備技術和治療方案，具有多樣性、復雜性和特殊性。但作為一種新型的生物治療產(chǎn)品，所有干細胞制劑都可遵循一個共同的研發(fā)過程，即從干細胞制劑的制備、體外試驗、體內(nèi)動物試驗，到植入人體的臨床研究及臨床治療的過程。整個過程的每一階段，都須對所使用的干細胞制劑在細胞質(zhì)量、安全性和生物學效應方面進行相關的研究和質(zhì)量控制。
本指導原則提出了適用于各類可能應用到臨床的干細胞（除已有規(guī)定的造血干細胞移植外）在制備和臨床前研究階段的基本原則。每個具體干細胞制劑的制備和使用過程，必須有嚴格的標準操作程序并按其執(zhí)行，以確保干細胞制劑的質(zhì)量可控性以及治療的安全性和有效性。每一研究項目所涉及的具體干細胞制劑，應根據(jù)本指導原則對不同階段的基本要求，結合各自干細胞制劑及適應證的特殊性，準備并實施相關的干細胞臨床前研究。
二.干細胞制劑的質(zhì)量控制
（一）干細胞的采集、分離及干細胞（系）的建立
1.對干細胞供者的要求
每一干細胞制劑都須具有包括供者信息在內(nèi)的、明確的細胞制備及生物學性狀信息。作為細胞制備信息中的重要內(nèi)容之一，需提供干細胞的獲取方式和途徑以及相關的臨床資料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要對遺傳病(單基因和多基因疾病,包括心血管疾病和腫瘤等）相關信息進行詳細采集。對用于異體干細胞臨床研究的供者，必須經(jīng)過檢驗篩選證明無人源特定病毒（包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）的感染，無梅毒螺旋體感染。必要時需要收集供者的ABO血型、HLA-I類和II類分型資料，以備追溯性查詢。如使用體外授精術產(chǎn)生的多余胚胎作為建立人類胚胎干細胞系的主要來源，須能追溯配子的供體，并接受篩選和檢測。不得使用既往史中患有嚴重的傳染性疾病和家族史中有明確遺傳性疾病的供者作為異體干細胞來源。
自體來源的干細胞供者，根據(jù)干細胞制劑的特性、來源的組織或器官，以及臨床適應證，可對供體的質(zhì)量要求和篩查標準及項目進行調(diào)整。
2.干細胞采集、分離及干細胞（系）建立階段質(zhì)量控制的基本要求
應制定干細胞采集、分離和干細胞（系）建立的標準操作及管理程序，并在符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）要求基礎上嚴格執(zhí)行。標準操作程序應包括操作人員培訓；材料、儀器、設備的使用和管理；干細胞的采集、分離、純化、擴增和細胞（系）的建立；細胞保存、運輸及相關保障措施，以及清潔環(huán)境的標準及常規(guī)維護和檢測等。
為盡量減少不同批次細胞在研究過程中的變異性，研究者在干細胞制劑的制備階段應對來源豐富的同一批特定代次的細胞建立多級的細胞庫，如主細胞庫（Master Cell Bank)和工作細胞庫（Working Cell Bank）。細胞庫中細胞基本的質(zhì)量要求，是需有明確的細胞鑒別特征，無外源微生物污染。
在干細胞的采集、分離及干細胞（系）建立階段，應當對自體來源的、未經(jīng)體外復雜操作的干細胞，進行細胞鑒別、成活率及生長活性、外源致病微生物，以及基本的干細胞特性檢測。而對異體來源的干細胞，或經(jīng)過復雜的體外培養(yǎng)和操作后的自體來源的干細胞，以及直接用于臨床前及臨床研究的細胞庫（如工作庫）中的細胞，除進行上述檢測外，還應當進行全面的內(nèi)外源致病微生物、詳細的干細胞特性檢測，以及細胞純度分析。干細胞特性包括特定細胞表面標志物群、表達產(chǎn)物和分化潛能等。
（二）干細胞制劑的制備
1.培養(yǎng)基
干細胞制劑制備所用的培養(yǎng)基成分應有足夠的純度并符合無菌、無致病微生物及內(nèi)毒素的質(zhì)量標準,殘留的培養(yǎng)基對受者應無不良影響；在滿足干細胞正常生長的情況下，不影響干細胞的生物學活性，即干細胞的“干性”及分化能力。在干細胞制劑制備過程中，應盡量避免使用抗生素。
若使用商業(yè)來源培養(yǎng)基，應當選擇有資質(zhì)的生產(chǎn)商并由其提供培養(yǎng)基的組成成分及相關質(zhì)量合格證明。必要時，應對每批培養(yǎng)基進行質(zhì)量檢驗。
除特殊情況外，應盡可能避免在干細胞培養(yǎng)過程中使用人源或動物源性血清，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動物血清，應確保其無特定動物源性病毒污染。嚴禁使用海綿體狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。
若培養(yǎng)基中含有人的血液成份，如白蛋白、轉鐵蛋白和各種細胞因子等，應明確其來源、批號、質(zhì)量檢定合格報告，并盡量采用國家已批準的可臨床應用的產(chǎn)品。
2.滋養(yǎng)層細胞
用于體外培養(yǎng)和建立胚胎干細胞及iPS細胞的人源或動物源的滋養(yǎng)層細胞，需根據(jù)外源性細胞在人體中使用所存在的相關風險因素，對細胞來源的供體、細胞建立過程引入外源致病微生物的風險等進行相關的檢驗和質(zhì)量控制。建議建立滋養(yǎng)層細胞的細胞庫，并按細胞庫檢驗要求進行全面檢驗，特別是對人源或動物源特異病毒的檢驗。
3.干細胞制劑的制備工藝
應制定干細胞制劑制備工藝的標準操作流程及每一過程的標準操作程序（SOP）并定期審核和修訂；干細胞制劑的制備工藝包括干細胞的采集、分離、純化、擴增和傳代，干細胞（系）的建立、向功能性細胞定向分化，培養(yǎng)基、輔料和包材的選擇標準及使用，細胞凍存、復蘇、分裝和標記，以及殘余物去除等。從整個制劑的制備過程到輸入（或植入）到受試者體內(nèi)全過程，需要追蹤觀察并詳細記錄。對不合格并需要丟棄的干細胞制劑，需對丟棄過程進行規(guī)范管理和記錄。對于剩余的干細胞制劑必須進行合法和符合倫理要求的處理，包括制定相關的SOP并嚴格執(zhí)行。干細胞制劑的相關資料需建檔并長期保存。
應對制劑制備的全過程，包括細胞收獲、傳代、操作、分裝等，進行全面的工藝研究和驗證，制定合適的工藝參數(shù)和質(zhì)量標準，確保對每一過程的有效控制。
（三）干細胞制劑的檢驗
1.干細胞制劑質(zhì)量檢驗的基本要求
為確保干細胞治療的安全性和有效性，每批干細胞制劑均須符合現(xiàn)有干細胞知識和技術條件下全面的質(zhì)量要求。制劑的檢驗內(nèi)容，須在本指導原則的基礎上，參考國內(nèi)外有關細胞基質(zhì)和干細胞制劑的質(zhì)量控制指導原則，進行全面的細胞質(zhì)量、安全性和有效性的檢驗。同時，根據(jù)細胞來源及特點、體外處理程度和臨床適應證等不同情況，對所需的檢驗內(nèi)容做必要調(diào)整。另外，隨著對干細胞知識和技術認識的不斷增加，細胞檢驗內(nèi)容也應隨之不斷更新。
針對不同類型的干細胞制劑，根據(jù)對輸入或植入人體前誘導分化的需求，須對未分化細胞和終末分化細胞分別進行必要的檢驗。對胚胎干細胞和iPS細胞制劑制備過程中所使用的滋養(yǎng)細胞，根據(jù)其細胞來源，也需進行針對相關風險因素的質(zhì)量控制和檢驗。
為確保制劑的質(zhì)量及其可控性,干細胞制劑的檢驗可分為質(zhì)量檢驗和放行檢驗。質(zhì)量檢驗是為保證干細胞經(jīng)特定體外處理后的安全性、有效性和質(zhì)量可控性而進行的較全面質(zhì)量檢驗。放行檢驗是在完成質(zhì)量檢驗的基礎上，對每一類型的每一批次干細胞制劑，在臨床應用前所應進行的相對快速和簡化的細胞檢驗。
為確保制劑工藝和質(zhì)量的穩(wěn)定性，須對多批次干細胞制劑進行質(zhì)量檢驗；在制備工藝、場地或規(guī)模等發(fā)生變化時，需重新對多批次干細胞制劑進行質(zhì)量檢驗。制劑的批次是指由同一供體、同一組織來源、同一時間、使用同一工藝采集和分離或建立的干細胞。對胚胎干細胞或iPS細胞制劑，應當視一次誘導分化所獲得的可供移植的細胞為同一批次制劑。對需要由多個供體混合使用的干細胞制劑，混合前應視每一獨立供體或組織來源在相同時間采集的細胞為同一批次細胞。
對于由不同供體或組織來源的、需要混合使用的干細胞制劑，需對所有獨立來源的細胞質(zhì)量進行檢驗，以盡可能避免混合細胞制劑可能具有的危險因素。
2.細胞檢驗
2.1 質(zhì)量檢驗
（1）細胞鑒別
應當通過細胞形態(tài)、遺傳學、代謝酶亞型譜分析、表面標志物及特定基因表達產(chǎn)物等檢測，對不同供體及不同類型的干細胞進行綜合的細胞鑒別。
（2）存活率及生長活性
采用不同的細胞生物學活性檢測方法，如活細胞計數(shù)、細胞倍增時間、細胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等，判斷細胞活性及生長狀況。
（3）純度和均一性
通過檢測細胞表面標志物、遺傳多態(tài)性及特定生物學活性等，對制劑進行細胞純度或均一性的檢測。對胚胎干細胞及iPS細胞植入人體前的終末誘導分化產(chǎn)物，必須進行細胞純度和/或分化均一性的檢測。
對于需要混合使用的干細胞制劑，需對各獨立細胞來源之間細胞表面標志物、細胞活性、純度和生物學活性均一性進行檢驗和控制。
（4）無菌試驗和支原體檢測
應依據(jù)現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》中的生物制品無菌試驗和支原體檢測規(guī)程，對細菌、真菌及支原體污染進行檢測。
（5）細胞內(nèi)外源致病因子的檢測
應結合體內(nèi)和體外方法，根據(jù)每一細胞制劑的特性進行人源及動物源性特定致病因子的檢測。如使用過牛血清，須進行牛源特定病毒的檢測；如使用胰酶等豬源材料，應至少檢測豬源細小病毒；如胚胎干細胞和iPS細胞在制備過程中使用動物源性滋養(yǎng)細胞，需進行細胞來源相關特定動物源性病毒的全面檢測。另外還應檢測逆轉錄病毒。
（6）內(nèi)毒素檢測
應依據(jù)現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》中的內(nèi)毒素檢測規(guī)程，對內(nèi)毒素進行檢測。
（7）異常免疫學反應
檢測異體來源干細胞制劑對人總淋巴細胞增殖和對不同淋巴細胞亞群增殖能力的影響，或對相關細胞因子分泌的影響，以檢測干細胞制劑可能引起的異常免疫反應。
（8）致瘤性
對于異體來源的干細胞制劑或經(jīng)體外復雜操作的自體干細胞制劑，須通過免疫缺陷動物體內(nèi)致瘤試驗，檢驗細胞的致瘤性。
（9）生物學效力試驗
可通過檢測干細胞分化潛能、誘導分化細胞的結構和生理功能、對免疫細胞的調(diào)節(jié)能力、分泌特定細胞因子、表達特定基因和蛋白等功能，判斷干細胞制劑與治療相關的生物學有效性。
對間充質(zhì)干細胞，無論何種來源，應進行體外多種類型細胞（如成脂肪細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等）分化能力的檢測，以判斷其細胞分化的多能性（Multipotency）。對未分化的胚胎干細胞和iPS細胞，須通過體外擬胚胎體形成能力，或在SCID鼠體內(nèi)形成畸胎瘤的能力，檢測其細胞分化的多能性（Pluripotency）。除此以外，作為特定生物學效應試驗，應進行與其治療適應證相關的生物學效應檢驗。
（10）培養(yǎng)基及其他添加成分殘余量的檢測
應對制劑制備過程中殘余的、影響干細胞制劑質(zhì)量和安全性的成分，如牛血清蛋白、抗生素、細胞因子等進行檢測。
2.2 放行檢驗
項目申請者應根據(jù)上述質(zhì)量檢驗各項目中所明確的檢驗內(nèi)容及標準，針對每一類型干細胞制劑的特性，制定放行檢驗項目及標準。放行檢驗項目應能在相對短的時間內(nèi)，反映細胞制劑的質(zhì)量及安全信息。
3.干細胞制劑的質(zhì)量復核
由專業(yè)細胞檢驗機構/實驗室進行干細胞制劑的質(zhì)量復核檢驗，并出具檢驗報告。
（四）干細胞制劑的質(zhì)量研究
在滿足上述干細胞制劑質(zhì)量檢驗要求的基礎上，建議在臨床前和臨床研究各階段，利用不同的體外實驗方法對干細胞制劑進行全面的安全性、有效性及穩(wěn)定性研究。
1.干細胞制劑的質(zhì)量及特性研究
1.1 生長活性和狀態(tài)
生長因子依賴性的檢測：在培養(yǎng)生長因子依賴性的干細胞時，需對細胞生長行為進行連續(xù)檢測，以判斷不同代次的細胞對生長因子的依賴性。若細胞在傳代過程中，特別是在接近高代次時，失去對生長因子的依賴，則不能再繼續(xù)將其視為合格的干細胞而繼續(xù)培養(yǎng)和使用。
1.2 致瘤性和促瘤性
由于大多數(shù)間充質(zhì)干細胞制劑具有相對的弱致瘤性，建議在動物致瘤性試驗中，針對不同類型的干細胞，選擇必要數(shù)量的細胞和必要長的觀察期。
在動物致瘤性試驗不能有效判斷致瘤性時，建議檢測與致瘤性相關的生物學性狀的改變，如細胞對生長因子依賴性的改變、基因組穩(wěn)定性的改變、與致瘤性密切相關的蛋白（如癌變信號通路中的關鍵調(diào)控蛋白）表達水平或活性的改變、對凋亡誘導敏感性的改變等，以此來間接判斷干細胞惡性轉化的可能性。
目前，普遍認為間充質(zhì)干細胞“不致瘤”或具有“弱致瘤性”，但不排除其對已存在腫瘤的“促瘤性”作用。因此，建議根據(jù)各自間充質(zhì)干細胞制劑的組織來源和臨床適應證的不同，設計相應的試驗方法，以判斷其制劑的“促瘤性”。
1.3 生物學效應
隨著研究的進展，建議針對臨床治療的適應證，不斷研究更新生物學效應檢測方法。如研究介導臨床治療效應的關鍵基因或蛋白的表達，并以此為基礎提出與預期的生物學效應相關的替代性生物標志物（Surrogate Biomarker）。
2.干細胞制劑穩(wěn)定性研究及有效期的確定
應進行干細胞制劑在儲存（液氮凍存和細胞植入前的臨時存放）和運輸過程中的穩(wěn)定性研究。檢測項目應包括細胞活性、密度、純度、無菌性等。
根據(jù)干細胞制劑穩(wěn)定性試驗結果，確定其制劑的保存液成份與配方、保存及運輸條件、有效期，同時確定與有效期相適應的運輸容器和工具，以及合格的細胞凍存設施和條件。
3.快速檢驗方法的研發(fā)
應根據(jù)新的干細胞基礎及實驗技術研究成果，針對各自干細胞制劑的特性、特定的臨床適應證，研發(fā)新的快速檢驗方法，用于干細胞制備過程各階段的質(zhì)量控制和制劑的放行檢驗。
三.干細胞制劑的臨床前研究
應進行干細胞制劑的臨床前研究，為治療方案的安全性和有效性提供支持和依據(jù)。
在臨床前研究方案中，應設計和提出與適應證相關的疾病動物模型，用于預測干細胞在人體內(nèi)可能的治療效果、作用機制、不良反應、適宜的輸入或植入途徑和劑量等臨床研究所需的信息。
應在合適的動物模型基礎上，研究和建立干細胞有效標記技術和動物體內(nèi)干細胞示蹤技術，以便于研究上述內(nèi)容，特別是干細胞的體內(nèi)存活、分布、歸巢、分化和組織整合等功能的研究。在綜合動物模型研究基礎上，應對干細胞制劑的安全性和生物學效應進行合理評價。
鑒于干細胞治療的特殊性，其臨床前的安全有效性評價具有較大難度和局限性，以下只提出一些基本的原則，具體的研究方案可根據(jù)這些原則制定。如進行的相關研究工作與下述原則不符，應提供相應的依據(jù)和支持性資料。
（一）安全性評價
1.毒性試驗
可通過合適的動物試驗模型觀察干細胞制劑各種可能的毒性反應，如細胞植入時和植入后的局部和整體的毒性反應。
如難以采用相關動物評價人干細胞的毒性，可考慮盡可能模擬臨床應用方式，采用動物來源相應的干細胞制劑，以高于臨床應用劑量回輸動物體內(nèi)，觀察其毒性反應。
2.異常免疫反應
對干細胞制劑特別是異體來源、經(jīng)體外傳代培養(yǎng)和特殊處理的自體或異體來源的制劑，應當通過體外及動物試驗評價其異常免疫反應，包括對不同免疫細胞亞型及相關細胞因子的影響。對胚胎干細胞及iPS細胞，在體外誘導分化后重新表達供體的HLA抗原分子，植入體內(nèi)后可能形成的免疫排斥反應，需進行有效評價。
3.致瘤性
對高代次的或經(jīng)過體外復雜處理和修飾的自體來源以及各種異體來源的干細胞制劑，應當進行臨床前研究階段動物致瘤性評估。建議選擇合適的動物模型，使用合適數(shù)量的干細胞、合理的植入途徑和足夠長的觀察期，以有效評價制劑的致瘤性。
4.非預期分化
非預期分化包括非靶細胞分化或非靶部位分化。建議利用特定的檢測技術，在體內(nèi)動物試驗中研究、評估和監(jiān)控干細胞非預期分化的可能性。
（二）有效性評價
1.細胞模型（見前述-干細胞制劑的質(zhì)量研究）
2.動物模型
用于觀察植入的干細胞或其分化產(chǎn)物改變模型中疾病的病理進程；研究干細胞的歸巢能力和免疫調(diào)節(jié)功能；通過分析干細胞植入后，特定細胞因子和/或特定基因表達情況，提出替代性生物學效應標志物。
若所申請的研究方案，因目前國際上干細胞生物學知識和技術方面的局限性，無法提出有效的體內(nèi)動物模型研究內(nèi)容，則應在臨床前研究報告中進行全面細致的說明。
名詞解釋：
干細胞制劑（Stem cell-based medicinal products）：是指用于治療疾病或改善健康狀況的、以不同類型干細胞為主要成分、符合相應質(zhì)量及安全標準，且具有明確生物學效應的細胞制劑。
胚胎干細胞（Embryonic stem cell）：源自第5-7天的胚胎中內(nèi)細胞團的初始（未分化）細胞，可在體外非分化狀態(tài)下“無限制地”自我更新，并且具有向三個胚層所有細胞分化的潛力，但不具有形成胚外組織（如胎盤）的能力。
成體干細胞（Somatic stem cell）：位于各種分化組織中未分化的干細胞，這類干細胞具有有限的自我更新和分化潛力。
間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stromal/stem cell， MSC）：一類存在于多種組織(如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等），具有多向分化潛力，非造血干細胞的成體干細胞。這類干細胞具有向多種間充質(zhì)系列細胞（如成骨、成軟骨及成脂肪細胞等）或非間充質(zhì)系列細胞分化的潛能，并具有獨特的細胞因子分泌功能。
祖細胞（Progenitors）：一類只能向特定細胞系列分化，并且只具備有限的分裂增殖能力的成體細胞。
前體細胞（Precursors）：一類只能向特定終末分化細胞分化的，較祖細胞更有限的增殖能力的成體細胞。
造血干細胞（Hematopoietic stem cell）：具有高度自我更新能力和多向分化潛能的造血前體細胞，可分化成紅細胞、白細胞、血小板和淋巴細胞。
誘導的多能性干細胞（Induced pluripotent stem cell, iPS）：一類通過基因轉染等細胞重編程技術人工誘導獲得的，具有類似于胚胎干細胞多能性分化潛力的干細胞。
胚胎干細胞系（Embryonic stem cell line）：在體外培養(yǎng)的條件下，可保持未分化狀態(tài)連續(xù)增殖的胚胎干細胞。
全能性（Totipotent）：是早期數(shù)天胚胎中，具有分化成機體所有類型細胞和形成完全胚胎能力的干細胞。
亞全能性（Pluripotent）：是具有形成機體各種類型細胞，即所有三胚層來源細胞的能力，但不具有形成胚外胎組織細胞的能力。
多能性（Multipotent）：是指具有形成機體內(nèi)超過一種類型細胞的能力，但往往是針對特定細胞系列的。
滋養(yǎng)層細胞（Feeder layer）：是指通過細胞-細胞相互作用，或分泌蛋白或其他物質(zhì)，位于胚胎干細胞和iPS細胞的培養(yǎng)底層，以支持這些干細胞生長的動物源性或人源性細胞。
畸胎瘤（Teratoma）：一種含有三個胚層組織細胞和分化的組織的良性腫瘤。
參考文獻：
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